1. PeproGrow™ hESC的配方是什么？

PeproGrowTM hESC培养基是PeproTech与美国罗格斯大学干细胞培训中心合作研发的专有配方，不含血清和酚红，化学成分明确。每个PeproGrow™ hESC培养基试剂盒中包含一瓶基础培养基和一管单独的PeproTech重组生长因子冻干粉。

2. 如何储存PeproGrow™ hESC培养基？

基础培养基避光2°C - 8°C最长保存6个月，生长因子冻干粉组分2°C -8°C可保存6个月，-20°C至-80°C则可保存长达5年。

3. PeproGrow™ hESC培养基应该如何使用？

生长因子冻干粉在开盖前需离心，然后根据试剂盒的规格不同用100 µl或500 µl细胞培养级无菌水重悬。如果两周内能用完，则将全部的已重悬生长因子组分无菌操作加入基础培养基中，通过旋转或吹打充分混匀。如果两周内用不完，则需无菌操作取所需体积的基础培养基至一个无菌的聚碳酸酯(PC)瓶或锥形底聚丙烯(PP)管中，然后按比例加入已重悬的生长因子组分，并通过旋转充分混匀。如果整个过程均为无菌操作，配制完成后无需再次过滤除菌。在瓶子标签上标注配制时间及新的有效期(混合后2周)，避光保存于2°C - 8°C。细胞换液前，仅取当次所需量的培养基，复温后使用。

4. 从我目前使用的培养基更换为PeproGrow™ hESC培养基时必须进行适应培养吗？

在两种均含胰岛素的培养基间切换不必进行适应培养，而当从含胰岛素的培养基更换为不含胰岛素的培养基时则可能需要适应培养。是否需要适应培养液也与细胞类型有关。当快速方案(无适应培养)的效果不尽如人意时，额外的适应培养(短期或长期的)可能就有必要了。如果短期的适应培养不奏效时，可使用长期的适应培养，同时逐步提高新培养基的比例，如按100:0，80:20，60:40，20:80和0:100分步进行。请阅读PeproGrow™ hESC培养基使用手册，以获取更多信息。

5. 适应培养过程中出现分化正常吗？

在快速方案和适应培养中出现一些分化都是正常的。您可以刮除分化的克隆，或者挑取未分化的克隆至一个新的包被好的细胞培养皿上继续培养。请阅读PeproGrow™ hESC培养基使用手册，以获取更多信息。

6. 更换为PeproGrow™ hESC培养基后，我的细胞会发生改变吗？

尽管无法精确地预估细胞可能发生的变化，但在使用PeproGrowTM hESC培养基时克隆形态在可能会发生一些改变，比如细胞变得扁平等，但未观察到过细胞多能性和细胞表型的变化。在适应培养过程中，细胞可能会变得更加健壮，更能耐受传代所带来的损伤。请阅读PeproGrowTM hESC培养基使用手册，以获取更多信息。如果使用实验室常规的方法培养未发现细胞改变，则无需改变培养方法。

7. 细胞应在包被的还是未包被的培养器皿中培养？

不建议在未包被的塑料器皿中培养细胞。在适应培养的初始阶段，推荐用Corning Matrigel™包板，后面可使用其它合适的细胞外基质(ECM)。PeproTech为自己的干细胞培养基特制了一款包板试剂，即无动物成分的重组人Vitronectin(玻连蛋白)基质和缓冲液试剂盒(产品编号：AF-VMB-220)。该试剂可直接包板使用，也可与细胞预混后加入培养器皿。

8. 酶消化法传代后，细胞为什么贴壁不好？

原因最有可能是消化过度了。然而，消化后如仍有贴壁的克隆，可继续常规换液。4-6天后，有些细胞会茁壮长出，从其中挑选出2-4个克隆即可将您的培养维持下去。为避免过度消化，您可使用非酶消化法传代。注意：用无动物成分的重组人Vitronectin基质包板时，不能用酶消化法传代，此时应用仅含有PBS, HEPES和EDTA的等渗细胞传代/非酶法消化液(产品编号：CPD-125)来传代。

9. 酶消化传代后如果细胞贴壁不好，有什么改善的方法吗？

研究发现，添加2-10 µM(2 µM最佳)的Y-27632或ROCK抑制剂，可显著改善酶消化法(使用Dispase(分散酶)或Accutase™)传代后细胞的存活及贴壁情况。而过量的Y-27632除能引起可逆的形态学改变外，还可导致神经分化。

10. 关于细胞传代，还有其它建议吗？

下面是我们的一些建议，您也可以参阅PeproGrow™ hESC培养基使用手册。

确定合适的消化时间是细胞传代过程中至关重要的一步。使用Dispase酶消化时一定要避免过度消化，因为过度消化会造成克隆不贴壁或贴壁时发生自身折叠。

培养5-7天后，克隆很可能会长至足够大，此时可以传代。

出现一些细胞死亡是正常的。用Dispase酶法传代后，一定比例的细胞会不贴壁。但如果活细胞比例低于50%，则说明消化过头了。PBS/EDTA法传代则更为温和，正确操作时会有很好的克隆回收率。

11. 对于细胞传代的时机，你们还有什么建议？

传代时机很关键，如果传代过早，细胞会因克隆过小而铺板能力较差，且传代后不易存活。避免胶原酶的过度消化也极为重要。我们推荐使用Disapase酶或PBS/EDTA法，均是消化5分钟最佳，但在消化3分钟时需镜下观察细胞状态，以确定是否用满5分钟。

12. 细胞密度对克隆生长有什么影响？

细胞过疏或过密，均易引起自身分化。如传代比例过高，细胞将无足够的自分泌因子来提高其活力，许多细胞会死亡和/或分化，因此我们建议培养皿中的细胞在接近融合时传代。使用Dispase酶法传代时，可尝试1:6、1:12或1:18的传代比；而用PBS/EDTA法传代时，则可尝试1:6、1:12、1:18或1:24的传代比。如果需要，可进一步提高传代比。当使用Dispase酶法且细胞接种密度较低时，我们建议在传代时添加Y27632，如采用PBS/EDTA法，则无需添加。

13. 细胞铺板时需注意些什么？

我们建议沿着孔的边缘(仅针对六孔板)接种细胞，并轻轻地来回晃动培养板，使细胞混合均匀。如果使用其它规格的培养器皿，加细胞时可通过移动枪头来分散细胞。

14. 对于换液，有什么特别的建议吗？

每天换液。特殊情况下，可通过一次“双倍换液”来度过周末。

15. 我能用以上推荐的基质以外的基质来包被细胞培养器皿吗？

可以的。我们测试过几种其它的包板基质，包括Laminin/Entactin(BD™)，重组人Vitronectin(PeproTech；产品编号为140-09和AF-140-09)和Synthemax II® (Corning)。在标准的细胞培养塑料器皿上，以Laminin/Entactin作为包被基质，细胞生长状态可以达到与Corning Matrigel™近乎一致的水平。而以人Vitronectin和Synthemax II®作为包被基质时，则推荐使用CellBIND®或其它同等类型的细胞培养塑料器皿，才可达到最佳的包被效果。克隆的延展性和贴壁能力弱时有发生，此时需添加Y-27632处理一段时间。

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