由于神经退行性疾病的复杂成因，目前临床上尚缺乏有效的治疗方案，甚至对疾病病理进程也未完全了解。在研究 AD 的过程中，最先引起科研学者们注意的相关蛋白是 β 淀粉样肽，其出现在 AD 患者的大脑斑块中，被认为是导致神经元变性甚至死亡的原因[2]。因此最初的药物和治疗方案都是针对该蛋白，但令人失望的是，这些新药研发全军覆没。于是国内外更多的研究重点又放在了 tau 蛋白上。
不过，随着越来越深入的研究，科研学者们发现 AD 可能不是单纯由某一个蛋白致病，而是两种蛋白同时出现问题共同导致的疾病进程[3]，所以，科研学者决定重新对 β 淀粉样肽开展研究。
从结构和机制上来说，β 淀粉样肽简称 Aβ，是淀粉样肽前体蛋白（APP）的水解产物。APP 则是一种跨膜整合蛋白，存在于多种组织当中，尤其是在 AD 中有重要角色的神经元突触[4]。APP 蛋白水解之后释放 Aβ，而后聚集沉积，是淀粉样斑块的主要成分。Aβ 和 tau 蛋白以及 α 突触核蛋白都有类似的蛋白聚集机制，从单体到寡聚体再到原纤维，然后像种子一样诱导更多单体形成原纤维/聚集体。
从形式和特性上来说，Aβ 肽是单体，主要有两种形式 Aβ40 和 Aβ42，前者在正常老年人和 AD 患者脑中含量丰富，而后者主要存在于 AD 患者脑中[5]。Aβ42 非常不稳定且极其容易聚集，导致研究它的各种结构（单体、寡聚体、原纤维）非常困难[6]。由于 Aβ1-42 在水溶液中是无结构的，而非极性溶剂可以诱导 α 螺旋结构[7]，所以目前市面上常用的是 HFIP（1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇，一种非极性溶剂）处理的 Aβ 肽，使之稳定于单体状态。当 HFIP 中水的含量增加时，α 螺旋开始变成 β 折叠[7]，也就是聚集过程的开始，因此 Aβ 单体在运输和储藏过程中是干粉状态，需要防潮，避免水份的加入。
StressMarq 的 β 淀粉样肽 1-42（Aβ42）为合成肽，在干燥前用 HFIP 处理，从而可以分解前体原纤维并使肽单体化，一些文献中也使用该方法[8,9]。在 DMSO/dH2O 中重新悬浮后，当在 TEM、AFM 和具有抗 Aβ 抗体的蛋白质印迹下观察时，Aβ42 呈现为不含原纤维的单体肽。值得注意的是，与 Aβ42 寡聚体和原纤维相比，Aβ42 单体对原代大鼠皮层神经元没有毒性。
图 1. 从左至右分别为 Aβ 单体（SPR-485），寡聚体（SPR-488）和原纤维（SPR-487）的电镜图。负染色透射电子显微镜图像在 80 Kv 下在碳涂层的 400 目铜网格上使用磷钨酸和乙酸双氧铀染色获得。比例尺 = 100 nm。
图 2. 从左至右分别为 Aβ 单体（SPR-485），寡聚体（SPR-488）和原纤维（SPR-487）的原子力显微镜图。将 1.0 mg/mL 样品在 dH2O 中稀释至 0.1 mg/mL 置于新鲜切割的云母上，清洗、干燥并以轻敲模式进行原子力显微镜分析。上图为 2.5 x 2.5 µm x-y，z 范围为 10 nm。淀粉样斑块的出现一直被认为是 AD 疾病的象征，但是它出现的数量和节奏都与 AD 疾病的进程不符，所以近年来，研究学者们发现推动疾病进程更多的可能是 Aβ 寡聚体和原纤维。制作寡聚体和原纤维的步骤在很多文献都有描述[8~10]，以下图表为常用的处理方法：
图 3. Aβ 寡聚体和原纤维制作流程[10]
StressMarq 的 Aβ42 寡聚体使用 Aβ 肽由特殊方法制得，F12 细胞培养基方法也在投入生产。Aβ42 寡聚体在电子显微镜（图 1）和原子力显微镜（图 2）下显示出明显的球状结构，而在 WB（图 4）中使用抗 Aβ 抗体显示出独特的二聚体/三聚体和寡聚体信号。同时 Aβ 寡聚体对原代大鼠皮质神经元有毒性（图 5）。Aβ42 原纤维使用 Aβ 肽由 HCl 方法制得，在电子显微镜（图 1）和原子力显微镜（图 2)下显示出明显的长链状结构，而在 WB（图 4）中使用抗 Aβ 抗体显示出独特的高分子量信号。同时 Aβ 原纤维对原代大鼠皮质神经元有毒性（图 5）。
图 4. 从左至右分别是 Aβ 单体（SPR-485），寡聚体（SPR-488）和原纤维（SPR-487）的 WB，抗体是抗 Aβ6E10 抗体。三种 Aβ 蛋白（160 pmol）在 4%~12% Bis-Tris SDS-PAGE 上跑胶后，在 0.02% v/v Tween-20 存在下转移到硝酸纤维素上，并用 1:1000 小鼠 6E10 一抗做 WB。在 TEM/AFM 下观察到的寡聚体显示出明显的二聚体/三聚体条带以及来自 ~37-75 kDa 的信号（中）。在 TEM/AFM 下观察到的原纤维显示出大于 100 kDa 的信号，并且在浓缩胶（右）中有明显的信号。
图 5. Aβ 1-42 寡聚体（SPR-488）和原纤维（SPR-487）对原代大鼠皮层神经元显示出剂量依赖性毒性，但单体（SPR-485）没有毒性。大鼠原代皮层神经元用不同浓度的（A）单体、（B）寡聚体或（C）原纤维处理 14 天后的存活率，由 MAP2 阳性神经元量化并表示为对照的百分比（空白对照设为 100%）。原纤维和相应的载体对照先在 Bioruptor 超声破碎仪中进行超声处理。测试条件在与未处理的对照和载体对照相同的板中运行，由不含 Aβ 1-42 蛋白的缓冲液组成。数据表示为平均值 +/- s.e.m.（n = 6）。使用单向方差分析和 Dunnett 检验对数据进行全局分析；** p < 0.01 统计数据相比于对照；## p < 0.01, #### p < 0.0001 统计数据相比于载体对照。§ 代表未经处理的对照条件。
总的来说，StressMarq 的 Aβ 单体、寡聚体和原纤维都可以应用于 WB，以及体内和体外实验。StressMarq 的 Aβ 寡聚体在毒性方面有潜力成为更好的建模工具，更多数据或产品详情，可联系一级代理商-欣博盛生物
参考文献：
[1]. https://www.bjnews.com.cn/detail/160067807215569.html
[2]. Shankar, G.M. et al. Amyloid-b protein dimers isolated directly from Alzheimer’s brains impair synaptic plasticity and memory. Nat Med. 2008 Aug;14(8):837-42.
[3]. Eisenberg, D.S. and Sawaya, M.R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annu. Rev. Biochem. 2017. 86:69–95.
[4]. Chen, G.F. et al. Amyloid beta: structure, biology and structure-based therapeutic development. Acta Pharmacol Sin. 2017 Sep;38(9):1205-1235.
[5]. Qiao L, Sun Y, Qu Z. Research situation of tau proteins and β-amyloid protein in the pathological process and autophagic mechanisms in Alzheimer′s disease. Chin J Diagnostics(Electronic Edition), 2019,7(2): 94-97.
[6]. LeVatte,M.A. et al. Preparation and characterization of a highly soluble Aβ1-42 peptide variant. Protein Expr Purif. 2019 Dec;164:105480.
[7]. Zhang-Haagen, B. et al. Monomeric Amyloid Beta Peptide in Hexafluoroisopropanol Detected by Small Angle Neutron Scattering. PLoS One. 2016; 11(2): e0150267.
[8]. Stine et al. In Vitro Characterization of Conditions for Amyloid-β Peptide Oligomerization and Fibrillogenesis.2003. JBC. 278(13):11612-22.
[9]. Chromy et al. Self-Assembly of Aβ1-42 into Globular Neurotoxins. 2003. Biochemistry. 42:12749-12760.
[10]. Dahlgren, K.N.. et al. Oligomeric and Fibrillar Species of Amyloid-β Peptides Differentially Affect Neuronal Viability. J Biol Chem. 2002 Aug 30;277(35):32046-53.
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