细胞因子是一种分子量较小的蛋白质，可促进免疫细胞之间的信号传递，协调对感染病原体和肿瘤发生的反应以及整体免疫稳态，吸引各种免疫相关疾病的临床前和临床研究人员将其作为研究对象。它们在免疫反应中起着关键作用，基于细胞因子的治疗方法展示了免疫疗法的新发展。然而，制约细胞因子的疗效的因素有其在血液循环中短的半衰期、多向性和不利的生物分布。目前一些创新的细胞因子工程技术有助于应对这些制约因素，但通常无法用于基础研究的方向。
所以AdipoGen适时推出InVivoKines系列重组蛋白，该系列是新一代重组融合蛋白，用于免疫治疗、临床前和体内转化研究。InVivoKines系列蛋白是基于Fc的融合蛋白，采用KIH（Knobs-into-Holes）技术开发。
InVivoKines系列产品特点
• 具有天然构象——由HEK 293或CHO细胞中表达产生
• 无动物源成分条件下生产
• 通过ELISA和基于细胞的分析测试具有高生物活性
• 通过SEC验证纯度和同质性
• 低内毒素水平
• 批次间一致性高
KIH（Knobs-into-Holes）技术生产InVivoKines系列Fc融合蛋白简介
KIH（Knobs-into-Holes）概念是Ridgway等人在1996年提出的一种开创性的设计思路，允许重链异二聚化，产生“具有两条不同臂的IgG”，通常用于设计在药物开发中起重要作用的双特异性抗体。它允许通过操纵参与Fc二聚体相互作用的关键氨基酸残基来产生互补的相互作用界面。具有较小侧链的氨基酸被具有较大侧链的氨基酸取代，从而在一条链上产生一个突起，反之则在伴侣链上产生一个孔。传统上，一个CH3结构域中的T366Y突变被用于产生一个突起，而另一个CH3结构域中的Y407T突变产生一个孔。这种突变建立了分子间相互作用，并由于突起和孔配对而促进异二聚体的形成。由于分子固有的复杂性，高纯度KIH双特异性生物蛋白的生产具有一定困难。KIH的有效共表达依赖于突起和孔的等量表达。
Adipogen的Fc-KIH技术允许Fc异二聚化产生具有两个不同臂的结构，以产生天然存在的活性单体、异二聚体或同二聚体蛋白质。拥有Fc-KIH结构域的细胞因子可延长细胞因子的血浆半衰期，从而在保持活性的同时显著改善药代动力学（PK）。延长半衰期原理在于IgG/Fc结构域（IgG）和新生FcR（FcRn）的结合可以保护抗体和Fc融合蛋白不被降解，从而延长血清中的半衰期。在酸性条件下（pH6.0-6.5），FcRn与IgG结合，在中性和弱碱性条件下（pH7.0-7.5）发生解离。内皮细胞通过摄取IgG形成酸化的内体而形成内吞小泡，IgG与FcRn结合形成IgGs-FcRn复合物。IgG-FcRn复合物通过再循环的内体转运到细胞表面。在pH7.4等生理条件下，IgG-FcRn复合物解离，IgG再次释放到血液循环中。通过这种受体介导的再循环机制，FcRn有效地保护IgG免受溶酶体降解，从而延长了IgG的半衰期。Knobs-into-Holes（KIH）-Fc结构域显示出与标准Fc融合结构域或抗体IgG相似的特性，可参考文献：The Role of Fc Receptors on the Effectiveness of Therapeutic Monoclonal Antibodies: P. Gogesch, et al.; Int. J. Mol. Sci. 22, 8947 (2021)
Fc-KIH结构域与Fcγ受体（FcγRs）和补体C1q结合，可能导致ADCC、ADCP和CDC效应。Fc-KIH的LALA-PG突变会抑制其与FcγRs和C1q的结合，而FcRn结合和Fc稳定性不受影响。具有Fc-KIH结构的蛋白是在内毒素含量很低的哺乳动物细胞中产生。Fc-KIH蛋白不仅能用于体内研究，也适用于体外实验。
图1.AdipoGen Life Sciences利用KIH技术开发单体、异二聚体或同二聚体Fc融合蛋白示意图。
基于IgG的效应功能介绍
基于IgG抗体和Fc融合蛋白是临床前和治疗应用中开发的生物蛋白类产品。它们与免疫系统的交流由Fcγ受体（FcγRs）控制和介导，FcγRs是一种膜结合蛋白。这类生物蛋白类产品包含抗原结合位点，具有特异性和亲和力以及具有可以与免疫细胞表面以及血液中的补体（C1q）和FcRn表达的Fc受体（FcγRI、FcγRII、FcγRIII）结合的Fc片段，从而激活免疫效应。Fc结构域介导的效应功能包括抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC）、抗体依赖细胞介导的吞噬作用（ADCP）和补体依赖细胞毒性（CDC），所有这些都是通过Fc结构域与不同细胞类型上的Fc受体的相互作用介导的。
ADCC:效应细胞上的FcRs与靶细胞上生物蛋白的Fc区结合，导致溶解酶的分泌和细胞死亡诱导分子的表达，从而诱导靶细胞溶解。
ADCP:吞噬细胞上的FcRs与靶细胞或免疫复合物上的生物蛋白的Fc区结合，通过吞噬作用促进清除。
CDC: C1q与靶细胞上生物蛋白的Fc结构域结合，触发补体级联和膜攻击复合物（MAC）的组装，导致细胞溶解。
图3. IgG1抗体或Fc融合蛋白的作用机制由直接效应和间接效应组成，包括抗体依赖性细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性细胞吞噬作用（ADCP）和补体依赖性细胞毒性（CDC）示意图。
InVivoKines系列重组蛋白产品列表
产品名称 | 货号 | Protein Construct | Fc-KIH Silenced |
IL-2 Superkine (monomeric):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0222 | Monomer | No |
IL-2 Superkine H9T (monomeric):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0223 | Monomer | No |
IL-2 (human) (monomeric):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0224 | Monomer | No |
IL-2 (mouse) (monomeric):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0225 | Monomer | No |
IL-2 (human) (Switch-2) (monomeric):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0234 | Monomer | No |
IL-7 (human) (monomeric):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0238 | Monomer | No |
IL-7 (human) (monomeric):Fc (LALA-PG)-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0247 | Monomer | LALA-PG |
IL-12 (mouse):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0240 | Heterodimer | No |
IL-21 (mouse) (monomeric):Fc (LALA-PG)-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0250 | Monomer | LALA-PG |
IL-23 (mouse):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0235 | Heterodimer | No |
IL-23 (mouse):Fc (LALA-PG)-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0248 | Heterodimer | LALA-PG |
IL-27 (mouse):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0236 | Heterodimer | No |
IL-27 (mouse):Fc (LALA-PG)-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0249 | Heterodimer | LALA-PG |
IL-33 (oxidation resistant) (human) (monomeric):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0233 | Monomer | No |
IL-37 (human) (monomeric):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0221 | Monomer | No |
IL-38 (aa 1-152) (human) (monomeric):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0241 | Monomer | No |
IL-38 (aa 20-152) (human) (monomeric):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0226 | Monomer | No |
IL-38 (aa 3-152) (mouse) (monomeric):Fc-KIH (human) (rec.) | AG-40B-0227 | Monomer | No |
Fc (LALA-PG)-KIH (human):GDF15 (mouse) (rec.) | AG-40B-0245 | Heterodimer | LALA-PG |
Fc (LALA-PG)-KIH (human):Irisin (monomeric) (rec.) | AG-40B-0246 | Monomer | LALA-PG |
Fc-KIH (human) IgG1 Control (rec.) | AG-35B-0015 | Control | No |
Fc (LALA-PG)-KIH (human) IgG1 Control (rec.) | AG-35B-0018 | Control | LALA-PG |
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