基于需要递转不同种类核酸/蛋白类型研究，在细胞转染环节，研究者们常碰到如下三类问题：

1、细胞对化学试剂较为敏感，转染后，细胞活率下降或死亡；

2、研究常用细胞类型较多，不同类型细胞，转染效率差异较大，导致单个转染试剂或者实验流程，无法满足实验需求；

3、递转多种类型核酸或蛋白，需要挑选对应的转染试剂，并且需要大量实验优化，才可以得到较高的转染效率。

有没有一款化学转染试剂，可以同时应对常规到难转染的细胞类型，有着较低的细胞毒性，并且适用于多种核酸/蛋白类型递转呢？兼具多重功能、高性能的TransIT-X2^®转染试剂，可同时应对常见细胞及难转染细胞类型，避免条件摸索、大量的重复性实验，轻松地得到您理想的实验结果。

● 已验证在大多数细胞类型中(如贴壁/悬浮细胞、原代细胞、神经细胞等)，都有着优异的转染效率、低毒性(特别相对于形成脂质体复合物的Lipofectamine^®系列试剂)、高性能的表现；

● 适用于多种研究领域，包括不限于干细胞研究、基因编辑CRISPR研究、RNAi基因干扰/沉默、稳转细胞株构建、低毒性的转染实验、共转染实验等；

● 允许高效且稳定的同时递转多种核酸/蛋白类型，包括不限于质粒 DNA、siRNA/miRNA 和 CRISPR/Cas9 组分。

图1、Mirus产品年鉴

为什么 Mirus TransIT-X2^® Dynamic Delivery System （请见访问链接：https://www.mirusbio.com/product/transit-x2-dynamic-delivery-system-0-3-ml-0-3-ml/ ）有着如此高性能及广泛适应性呢？这归因于Mirus强大且高效的专利递转平台设计，可进行多重、多功能组合的转染试剂组分筛选并优化。成立于1995年的Mirus，专注及深耕核酸递转领域多年，从最早具有低毒性的TransIT ^® -LT1到GMP级别、可用于AAV和LV生产的TransIT-VirusGEN^®，都是基于该递转平台进行设计及开发。直至文稿发布时，使用Mirus产品发表文章已超过1万篇，并且发表文章及Mirus数据库涵盖了超过1千2百种细胞类型，更多文章及数据查询，请见访问链接：https://www.mirusbio.com/citation-search/。

图2、Mirus转染试剂原理示意图

不同于传统基于单组分的转染试剂(如阳离子聚合物或阳离子脂质体)，为了进一步提高转染效率，以应对不同细胞类型或特定的应用。Mirus将专利的多聚物(Polymer)及脂质(Lipids)技术进行多重组合，在不形成脂质体复合物(liposome，通常具有细胞毒性)前提条件下，得到多种类、高性能的转染方案，克服细胞递转过程中的多重阻碍，以实现更高效转染和更低的细胞毒性(图2)。

图3、Mirus独有智能迭代设计，转染试剂优化流程示意图

基于上述Mirus强大、高效的专利递转平台设计，在进行多重、多组合筛选、优化及后续验证。独有的智能迭代设计流程，优化转染技术中的每个组分。Mirus推出一系列经典转染试剂，以应对多种需求：

1、广谱、高性能、低毒性的转染试剂家族: TransIT-X2^®、TransIT^®-LT1、TransIT^®-2020

2、针对特定细胞类型的转染试剂家族：TransIT^®-293、TransIT^®-BrCa、TransIT^®-CHO、TransIT-HeLaMONSTER^®、TransIT^®-Insect、TransIT^®-Jurkat、TransIT^®-Keratinocyte

3、针对特定应用的转染试剂家族：

★.病毒生产：VirusGEN^® 转染试剂及配套试剂盒、TransIT^®-Lenti

★.蛋白/抗体生产：TransIT-PRO^®、CHOgro^® Expression System、CHOgro^® High Yield Expression System

4、寡核苷酸递转的转染家族：TransIT^®-Oligo、TransIT-siQUEST^®、TransIT-TKO^®

5、mRNA及长链RNA递转：TransIT^®-mRNA

  Mirus TransIT-X2^® 转染试剂性能数据 展示图  

4、TransIT-X2^®Dynamic Delivery System在包括原代细胞多种细胞类型中，具有较高转染效率。

Mirus TransIT-X2^®Dynamic Delivery System递转表达EGFP质粒DNA分别至A549、CHO-K1、Hep G2、MDCK、LNCaP、PC-12、原代人乳腺上皮细胞(HMEC)和正常人真皮成纤维细胞(NHDF)细胞中。实验使用96孔板， TransIT-X2^®试剂加入量为0.2-0.4µl，DNA加入量为0.1µg(使用试剂:DNA=2:1、3:1或4:1)。转染后48小时，使用Guava^® easyCyte™ 5HT流式细胞仪重复检测三次，评估转染效率。

图5、相较于使用单一组分且形成阳离子脂质体复合物(liposome)的Lipofectamine^®系列转染试剂，TransIT-X2^®有着更高的转染效率及更低细胞毒性

使用TransIT-X2^®(Mirus Bio)、Lipofectamine^®2000 (Thermo Fisher Scientific)或Lipofectamine^®3000 (Thermo Fisher Scientific)转染荧光素酶编码质粒DNA至A549 (A)或MDCK (B)细胞中，转染24小时，通过荧光素酶活性评估转染效率，定量受损细胞中释放的LDH评估细胞毒性。与Lipofectamine^®2000或Lipofectamine^®3000的细胞相比，在最佳试剂:DNA比例下，Trans - x2^®有着更高的荧光强度及更低的细胞毒性。

实验Tips: 针对更多特定细胞类型，试剂使用建议，详细请见：https://hub.mirusbio.com/m/d6a018920beec12e/original/Protocol-Optimization-Card.pdf

  Mirus TransIT-X2^® 在RNAi干扰实验中性能数据展示  

图6、不同RNAi干扰途径示意图

基因沉默相关功能研究在分子和细胞生物学中发挥着重要作用，化学转染也在该研究领域扮演者重要角色。常见参与RNAi干扰途径的天然RNA分子包括：

★.小干扰 RNA (Small interfering RNAs, siRNA) ：由双链 RNA(dsRNA)断裂所产生的短双链 RNA(20-25bp)；

★.微小 RNA(MicroRNAs, miRNAs) ：非编码 RNA 处理后所产生的一类短的、单链 RNA(20-22nt)。

利用 RNAi 抑制基因表达的另一种方法为短发夹 RNA(short hairpin RNA , shRNA)，这些短 RNA 序列可通过病毒或非病毒载体方式进行表达，更多详细信息可查阅Mirus Applications | RNAi Gene Silencing。

请见访问链接：https://www.mirusbio.com/applications-rnai-gene-silencing/

图7、基于siRNA核酸递转类型的基因沉默研究，相比Lipofectamine^® 2000，TransIT-X2^®有着更高的基因沉默效率

TransIT-X2^®Dynamic Delivery System和Lipofectamine^®2000转染试剂用于转染siRNA(靶点为内源性蛋白质- GAPDH和AHA1)，对照使用正常人类真皮成纤维细胞(NHDF)递转非靶向siRNA。Trans IT-X2^®加入量为4µl， Lipofectamine^®2000加入量为6µl，siRNA加入量都为25 nM。使用qRT-PCR相对于18s rRNA水平测量GAPDH或AHA1 mRNA进行检测，转染后48小时均一化至非靶向对照组的mRNA水平，误差则为三次复孔实验的标准差。

图8、基于miRNA (miRNA Precursor及miRNA mimic)基因沉默研究，相比Lipofectamine^® 2000，TransIT-X2^®有着更高的基因沉默效率

TransIT-X2^®Dynamic Delivery System和Lipofectamine^®2000转染试剂用于转染Pre-miR™ hsa-miR-1 miRNA Precursor 或者mirVana™ miRNA mimic, miR-1 (两者都已验证，可降低PTK9 mRNA表达水平)。Pre-miR™阴性质控用于评估mRNA表达水平基线值。Trans IT-X2^®及Lipofectamine^®2000试剂加入量都为3µl， 加入50 nM miRNA。使用qRT-PCR相对于18s rRNA水平，经过阴性质控的均一化，得到PTK9 mRNA表达水平值。

  Mirus TransIT-X2^® 在CRISPR基因编辑实验中性能数据展示  

经过改造及优化的细菌 CRISPR/Cas9 系统，已被广泛应用到哺乳细胞的基因编辑中。基于CRISPR基因编辑实验常见两组分：Cas9蛋白及引导RNA(gRNA)。当Cas9蛋白切割了靶向基因组DNA，会触发两种内源性修复机制，即非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)，以应对细胞中产生的DNA断裂。基于NHEJ细胞修复通路，为非精准、且容易出错细胞修复通路，可引入导致基因功能缺失的Indel。基于HDR的细胞修复通路，则需要额外的同源 DNA 作为修复模板，从而实现“精准”修复，在目的基因插入特定的基因或长片段序列。

【 根据研究者们不同的实验需求 】 

CRISPR基因编辑可以有多种类型实验设置，这意味需要面对不同核酸类型的转染甚至共转染，举例如下：

1、质粒pDNA转染

作为CRIPSR实验关键两组分：Cas9蛋白及gRNA，可以设计单个质粒DNA，共同表达两组分(A)；或者使用两质粒系统，其中一个质粒表达Cas9蛋白，另外一个质粒表达gRNA(B)；当使用Cas9切口酶(Nickase)，则需要两条gRNA，这时可能需要三质粒系统的递转实验。

2、质粒DNA及RNA寡核苷酸共转染

此时，与上述实验设计不同的是，gRNA以寡核苷酸形式进行递转，这就意味着递转实验需要同时转染质粒DNA以及RNA寡核苷酸(A和B)。

3、mRNA及RNA寡核苷酸共转染

为了避免由于质粒DNA基因组整合而导致的脱靶效应，可以共转染编码Cas9蛋白的mRNA及gRNA (RNA寡核苷酸)。

4、Cas9/gRNA RNP复合物递转

随着Cas9蛋白及gRNA商品化趋于成熟，越来越多的研究者们选择直接从第三方购买高保真Cas9蛋白，以及有着额外化学修饰且在细胞内更稳定的gRNA寡核苷酸。除了极大的缩短和简化CRISPR实验流程外，相对于质粒或者mRNA方式合成，直接递转RNP复合物的方式有着更高的特异性及编辑效率。

实验Tips: 针对上述不同CRISPR实验设计及递转情形，TransIT-X2^® Dynamic Delivery System经优化的具体实验说明

下载链接如下：

https://tools.mirusbio.com/assets/technical-documents/transit-x2-dynamic-delivery-system-for-crispr-cas9-plasmid-and-grna-delivery.pdf

https://tools.mirusbio.com/assets/technical-documents/transit-x2-dynamic-delivery-system-for-crispr-cas9-plasmid-delivery.pdf

https://tools.mirusbio.com/assets/technical-documents/transit-x2-dynamic-delivery-system-for-crispr-cas9-rnp-ssodn-delivery.pdf

https://tools.mirusbio.com/assets/technical-documents/transit-x2-dynamic-delivery-system-for-crispr-cas9-rnp-delivery.pdf

图9、质粒DNA和gRNA寡核苷酸共转染：TransIT-X2^®分别在293T/17、U2OS和NHDF细胞中共转Cas9质粒DNA与gRNA(RNA寡核苷酸)，都有着较高的基因编辑效率(18-48%)

使用TransIT-X2^® Dynamic Delivery System  (2 µl/孔，24孔板, Mirus Bio)共转染0.5 µg质粒DNA(表达Cas9蛋白)及50nM 2-part gRNA (PPIB基因)至HEK293T/17, U2OS 及NHDF细胞中，转染后48小时，T7E1验证切割效率。

图10、Cas9/gRNA RNP复合体递转：相较于Lipofectamine^®系列转染试剂，TransIT-X2^®有着更高的切割效率

2-part gRNA (PPIB基因，IDT) 及Cas9 蛋白(PNA Bio)形成RNP复合体，分别使用TransIT-X2^® Dynamic Delivery System(1 µl/孔， Mirus Bio)、Lipofectamine^® CRISPRMAX™ (1.5 µl/孔， ThermoFisher) 、Lipofectamine^® RNAiMAX (1.5 µl/孔, ThermoFisher) 、Lipofectamine^® 3000 (1.5 µl/孔ThermoFisher) 递转至293T/17及U2OS细胞中。测试gRNA两种使用量(6 nM或12 nM)，相同Cas9 蛋白加入量(6 nM)，转染后48小时，T7E1验证切割效率。

  Mirus TransIT-X2^® 产品优势  

☑、新型基于多组分开发的广谱型转染试剂(适用于多种细胞，包括难转细胞)；

☑、可同时转染核酸及蛋白，包括不限于DNA，siRNA/miRNA和CRISPR/Cas9复合物；

☑、不形成脂质体复合物，降低细胞毒性；

☑、满足多种应用：基因过表达、基因沉默、基因编辑、干细胞研究、稳转细胞株构建等。

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